METHODES PAR BIOPSIE

Sachant le caractère matrilinéaire de la vie sociale des orques, Barrett-Lennard a choisi de faire des analyses sur l’ADN mitochondrial ou ADNmt pour identifier les populations, et établir les filiations* génétiques entre jeunes et leur mère. Et également sur l’ADN nucléaire et les microsatellites pour déterminer la méthode de reproduction des orques et les liens de paternité.

L'ADN Mitochondriale :

La biologie moléculaire est une source d’information sur l’histoire de l’évolution des espèces. Nous savons que chaque être est apparenté à un autre génétiquement. Mais l’image que nous avons de l’évolution génétique n'est pas très claire.

D’abord parce que cette étude est basée sur la comparaison des gênes du noyau où les mutations sont très faibles. Ensuite parce que les gênes du noyau sont hérités des deux parents et sont mélangés à chaque génération.

De plus, les recombinaisons rendent difficiles le suivi d’un segment particulier d’ADN. Mais le noyau n’est pas le seul organite des cellules eucaryotes à contenir de l’ADN.

Les mitochondries, présentes dans toutes les cellules eucaryotes contiennent leur propre ADN : l’ADN mitochondrial. Cette petite fraction d’ADN extra-nucléaire est plus apte à la filiation génétique et c’est pour cela qu’elle est utilisée par les chercheurs pour déterminer les filiations entre mère et petits chez les orques.

Le type d’hérédité de l’ADN mt est cytoplasmique (ou non Mendélienne). En effet, comme chez les animaux supérieurs, la cellule de l’œuf apporte toujours plus de cytoplasme au zygote que le spermatozoïde. L’hérédité est uniparentale et plus précisément maternelle. Les analyses faites avec l’ADNmt ne peuvent donc pas renseigner sur le système de reproduction, ni sur la paternité, et c’est donc pour cela qu’on utilise aussi les microsatellites. ( Chan-ng-yok, 2004)

La région la plus variable de l’ADNmt est la région codante pour l’ARNr, sa séquence change 100 fois plus vite que pour l’ARNr du noyau. En ce qui concerne les régions codantes pour l’ARNt et les protéines, leurs évolutions se font 10 fois plus vite que les proportions conventionnelles. D’autres éléments entrent en compte dans le taux de mutation élevé de l’ADN mt, notamment le manque de recombinaison, le manque de fidélité dans la réplication et les réparations défectueuses. Ce taux varie de 2 à 4% par millions d’années. Cette accumulation de mutation donne une bonne vue de la diversité génétique. En plus, il n’y a pas une dérive génétique, ni de sélection d’allèle contrairement à l’ADN nucléaire. On peut donc, à partir d’un échantillon d’une même population, remonter à un ancêtre commun.

L’ADN mitochondrial est donc un outil génétique avec les particularités d’être petit, ne subissant pas de recombinaison, ayant un taux de mutation élevé et étant transmis par la mère.

Méthode d'extraction de l'ADNmt :

Les analyses génétiques ont été faites sur des orques de la planète entière, en analysant la diversité de l’ADNmt codant pour l’ATPase 6*, l’ATPase 8 et l’ARNtPro* en prélevant des échantillons grâce à un fusil à fléchettes pneumatique en aluminium léger. Ces échantillons ont un diamètre de 30mm à 5mm, composés de peau et de graisse d’animaux.

L’ADNmt a été extraite de ses compartiments que sont les mitochondries par la méthode classique au phénol et au chloroforme et séparée de ces lipides et de ces protéines associées. Elle est ensuite amplifiée à l’aide d’amorces PCR* propres à chaque espèce.

Ensuite, il faut faire un séquençage d’ADNmt, puis on peut visualiser les fragments séquencés à l’aide de la radioactivité ou par fluorescence. ( Barrett-Lennard and Ellis, 2001)

L'ADN nucléaire et microsatellite :

La stratégie est de faire des comparaisons interspécifiques d’ADN de microsatellites.
L’ADN nucléaire est l’ADN contenu dans les noyaux des cellules.

Les microsatellites sont très polymorphiques. Il s'agit de séquences répétées en tandem (de deux à six paires de base) d'ADN contigu (par exemple -------GAGAGAGAGAGA-------) qui sont répandues partout dans les génomes des vertébrés.

Le taux de mutation des microsatellites est élevé et en conséquence, ils ont tendance à être hypervariables. La méthode d’analyse s’effectue de la même manière que pour l’ADNmt.

L’ADN nucléaire et les microsatellites permettent de mettre en évidence la méthode de reproduction des orques et les liens de paternité. ( Barrett-Lennard and Ellis, 2001)